Cas9是CRISPR的手术刀，但有时它会错误编辑基因组正常部分，扰乱健康的功能，而不是修复引起疾病的基因。长期以来，科学家担心这可能会无意中导致健康的细胞变成癌症，而这些担忧在今年6月开始加深，当时有两项研究表明，即使是成功编辑的细胞也容易发生致癌突变。此外，7月在《Nature Biotechnology》上发表的一项研究表明Cas9可能导致无法检测到的遗传变化。

CRISPR-Cas9基因编辑系统具有治疗疾病的巨大潜力，但是对脱靶效应的担忧可能会延迟其发展，这促使世界各地的科学家提出了各种改进方法。今年5月，斯坦福大学和国家标准与技术研究所的一个团队宣布他们发明了一种名为MAGESTIC的新型基因编辑系统，旨在改善编辑DNA的修复过程。今年早些时候，波兰科学家表示，他们正在完善一种使用Cas9变体切割一条DNA而不是两条DNA的CRISPR版本。

近日，来自德克萨斯大学奥斯汀分校的科学家们提出，用Cas12a取代Cas9可能是解决现有CRISPR缺点的最佳方法。这项最新研究于8月2日发表在《Molecular Cell》。

Cas9是CRISPR技术中首次发现和最常用的酶，但众所周知，它有时不安全地靶向错误的基因甚至删除基因组的部分。而Cas12a不是一个新的发现，其他研究团队认为它可能比Cas9更精确，但先前的证据尚无定论。

Cas12a：一种比Cas9更精确的酶

Cas9和Cas12a都依赖于20个核苷酸的gRNA来识别靶DNA，在几个重要方面有所差异，这对研究和治疗具有重要意义。

首先，在其天然形式中，DNA切割酶Cas9与两种小RNA形成复合物，这两种小RNA都是切割活性所必需的；Cas12a系统更简单，因为它只需要一个RNA并且更小，使其更容易进入细胞和组织。

其次，也许最重要的是，Cas12a以不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时，它会在同一个位置切割两条链形成平末端，它们在重新连接时经常发生突变；而对于Cas12a复合物，两条链中的切口是粘性末端，这有望帮助实现精确插入，使研究人员能够更有效、更准确地整合DNA。

第三，Cas12a远离识别位点，这意味着即使靶DNA在切割位点发生突变，它仍然可能会被重新切割，从而允许多次机会进行正确的编辑。

第四，Cas12a系统为选择目标位点提供了新的灵活性。与Cas9一样，Cas12a复合物必须首先连接到称为PAM的短序列，并且必须选择与天然存在的PAM序列相邻的靶标。Cas12a复合物识别与Cas9不同的PAM序列，这可能是靶向例如疟疾寄生虫基因组甚至人类基因组的优势。

在这些最新的研究中，研究人员证明了Cas12a更加精确并找到了原因，他们发现Cas9在识别gRNA中20个碱基的7或8个碱基后，就开始与其目标DNA结合；而Cas12a在与目标DNA完全结合之前似乎识别了多达18个碱基，这个过程中如果发现不匹配，它会在结合之前脱落。

这一点十分关键，因为人体内的DNA在身体周围循环，这些DNA具有非常相似的碱基，可能导致编辑错误的DNA，匹配的碱基越多就意味着有更低的脱靶率、更高的安全性。这也解释了为什么Cas12a酶在大多数情况下可能比Cas9更安全、更精确。

每种酶都带有一小段用RNA编写的遗传密码（PAM），它与病毒DNA中编写的目标遗传密码相匹配。当它碰到一些DNA时，酶开始试图通过形成碱基对来与它结合，从一端开始并沿着它的方向前进，测试每个DNA碱基与RNA的匹配程度。

对于Cas9，每个碱基对紧紧地粘在一起，就像超级胶水一样。如果每侧的前几个碱基匹配良好，那么Cas9已经与DNA紧密结合。这意味着它很容易忽略过程中的不匹配，导致它编辑错误的部分。

对于Cas12a，它更像是一个魔术贴，在沿途的每个点，结合得相对较弱。因此，在整个地带都需要一个很好的匹配，才能够长时间地进行编辑。这意味着碱基对形成的过程更加可逆，换句话说，Cas12a可以更好地检查每个碱基对，然后再转到下一个碱基对。这使得它更有可能只编辑基因组的预期部分。

本文的研究作者Ilya Finkelstein教授说：“我们的研究为什么不从大自然赋予我们的最佳蛋白质（Cas12a）开始并且进行改进？未来，我们希望改进Cas12a以达到匹配gRNA的20个碱基。”

Cas12a的切割机制如图，首先Cas12a上的gRNA能识别靶DNA链上的PAM序列，如果它们正确地匹配，就会结合成一种RNA-DNA螺旋（R-环）结构。当完整的R-环形成时，Cas12a酶才结合和切割这条靶DNA。

研究人员发现，Cas12a基本上每个完全结合事件都会导致DNA的切割，因此可以确定必须通过结合动力学来决定Cas12a对错配的特异性。

为了检测Cas12a对gRNA和靶DNA之间错配的特异性，研究人员在R环的每个位置引入了DNA中的单碱基对变化（错配），测量了Cas12a从这些错误的DNA靶标的结合和解离速率。

结果表明，R环内除了一个错配之外的所有错配都增加了解离速率。有趣的是，解离率的最大增加是由PAM远端错配引起的，除了一个错配产生3倍（T14C）的较小增加，PAM-远端错配使解离速率增加6至80倍。相比之下，PAM-近端错配增加的Cas12a解离率仅达到5倍。

他们认为，Cas12a-gRNA与靶DNA结合时，Cas12a特异性在R-环形成期间确定，R环的形成具有晚期过渡态，并且它的形成是通过规定的途径，首先从PAM开始，并且在过渡态中，PAM-近端碱基对用于R-环形成的程度远大于PAM-远端碱基对。尽管整个结合过程具有不可逆转的性质，但这种晚期过渡态允许Cas12a区分错配，因此解离率增加。

这表明工程化核酸酶可以将过渡态进一步转移到R-环的PAM-远端区域，从而扩展基因编辑应用的区域和整体特异性水平。

动力学分析证明，Cas12a与靶DNA的结合涉及两个步骤（机制）：

（1）初始步骤代表识别PAM序列，这是快速且可逆的；

（2）接下来，R-环以速率常数rv0.1s-1在PAM附近形成，随即快速扩大；完全形成R-环后，非靶标链（NTS）的裂解快速发生，靶标链（TS）的裂解发生缓慢10倍。

该团队目前正在一个后续项目中使用这些结果，旨在设计改进的Cas12a。

IlyaFinkelstein教授说：“总的来说，Cas12a更好，但是有些地方Cas12a仍然令人惊讶地对其RNA和基因组靶标之间的错误配对视而不见。因此，我们所做的工作是进一步改进Cas12a以建立一个防错的基因编辑系统。”

新型CRISPR酶助力基因编辑技术

去年，张锋研究团队测试了来自15种不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最终发现LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更强的特异性在靶RNA上切割特定位点，脱靶效应低。另外，他们还找到了Cas13的“死亡变体”，结合RNA却不能进行切割作用，并且可通过结合荧光标记来追踪RNA的轨迹。

《Mol Cell》上的一项研究发现，Cas13b像Cas13a一样，仅需要单个向导RNA就能找到靶标，并且从遗传学的角度是可编码的。此外，Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。但Cas13b的一些特性表明其更适用于微调基因功能。

今年2月，Broad研究所的大牛David Liu通过加速Cas9酶在实验室中的演化，并不断累积Cas9的特定突变，带来了全新的进化版Cas酶——xCas9，比起目前使用最广泛的spCas9，xCas9在转录激活、DNA剪切、单碱基编辑等方面的应用范围扩大了四倍。同时，xCas9的脱靶效应比spCas9低得多，部分序列的试验数据仅有原始版的1/100。

3月，Salk研究所的Patrick D. Hsu博士带领团队，开发出了一种新的靶向RNA的基因魔剪——CasRx，这是一种来自肠道细菌Ruminococcus flavefaciensXPD3002的Cas13d酶。与靶向RNA的其他技术相比，CasRx是独特的，因为它尺寸小、有效性高，且与RNA干扰相比，没有产生明显的脱靶效应。

结语

CRISPR基因编辑技术给许多遗传疾病和罕见病带来了希望，CRISPR系统的进一步完善，安全性的逐步提高是未来必然的方向。Cas9是CRISPR中最常用的酶，这次研究或许能促进对CRISPR使用的酶的机制的阐明以及酶工程的改造。CRISPR技术还有待深入开发，不管是版本还是使用途径，期待未来科学家能运用得如鱼得水，创造更多的可能。