最近，美国康涅狄格大学和南京农业大学李义教授团队在Horticulture Research发表了题为“A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants”的研究论文，首次系统报道利用农杆菌在植物细胞中瞬时表达Cas9和sgRNA序列而产生非转基因突变体并高效快速筛选的新方法。

该技术为童期长的多年生植物和有性生殖后会产生性状分离的杂合一年生植物提供了一个快速获得不含有外源基因的基因编辑突变体的新方法。

1背景知识

以CRISPR /Cas9为代表的基因编辑技术正在被广泛地应用于植物基因功能鉴定和品种改良等领域。为了获得基因编辑植株，即突变体，一般情况下是将Cas9和sgRNA等外源序列整合到植物基因组后，通过它们的稳定表达实现目标基因的编辑，获得突变体。对于遗传背景纯合的一年生植物，常用的方法是通过有性自交或杂交，使导入的外源基因和突变位点分离，从而获得不含有外源基因的突变植株。但是对于童期为几年甚至十几年的多年生植物（特别是木本植物）和通过无性繁殖的杂合一年生植物，获得非转基因突变体要么周期长要么技术难度大。

农杆菌介导法是目前最成熟、最简单的植物遗传转化方法，已经被广泛应用于一年生和多年生植物遗传转化。当农杆菌侵染植物细胞，单链的T-DNA进入植物细胞后，合成为双链。游离在细胞核中的双链T-DNA上的基因即使未整合到植物基因组上也可以表达，这种表达被称为瞬时表达。

2方法与结果

以烟草作为模式植物，李义教授团队的实验表明，T-DNA上的GUS报告基因在共培养的第3天和第4天时达到瞬时表达的峰值（图A）。然后，他们用载体T-DNA上带有Cas9和突变PDS（phytoene desaturase）基因的sgRNA的农杆菌侵染植物，共培养3天之后转入含杀菌抗生素的芽再生培养基。培养和再生的全过程不加筛选转基因细胞（植株）的抗生素或除草剂。几周后获得大量的再生苗，其中少量为pds的突变植株（图B）。他们获得pds突变体（白化苗）的平均效率为48%（突变芽/外植体），但是若以全部再生的植株为基数，白化pds突变体的频率为2.6%。

该方法在农杆菌侵染后不加筛选压的条件下进行植物再生，因此再生过程中会产生大量野生型植株。与pds突变体不一样，大多突变体在幼苗期没有可识别的表型，因此如何从众多的再生植株中鉴定出突变体是获得非转基因突变植株的关键之一。

李义教授团队应用高通量测序结合高分辨率熔解曲线分析（High Resolution Melting，HRM）的方法实现对突变植株的高效快速鉴定。他们将再生植株分为每42或84株一组的群体（待测群体），特异性扩增待测群体PDS基因上涵盖sgRNA序列的DNA片段，作为深度测序的母样品。同时用以野生型植物为模板扩增的DNA产物对母样品作7倍稀释，得到稀释后的子样品。然后将100%野生型、母样品和子样品同时进行高通量测序分析。图C可见，在含有41株野生型和一株pds-12突变体的母样品里，在AGATGAT等7个位点上，母样品的测序变异频率（红三角）相比100%的野生型（黑色圆点）显著提高。这说明这些位点可能有突变。但是，这些位点测序变异频率的增加也可能是由测序本身的误差造成的。此时，使用野生型DNA 7倍稀释得到的子样品的测序结果可用于鉴别突变的真实性。如果稀释后的子样品的这7个位点的测序变异频率（蓝色方块）与母样品一致，说明高变异率由测序误差造成。如果变异频率显著下降，则说明这7个位点确实存在突变。

该团队的稀释检测的新方法简单可靠地解决了测序本身带来的假阳性的问题。他们报道一共检测8个1/42的群体（每个群体有42个植株，其中5个群体，每个群体包含1株突变体，另3个群体不含有突变体），测序鉴定结果与实际情况完全相符，其筛选突变体的准确率为100%。

为了进一步鉴定含有42个植株的群体中的单个突变体，李义教授团队釆用了高分辨率熔解曲线分析方法。将高通量测序鉴定得到的每一个由42个植株组成的含有突变体的待测群体，进一步分为每7个植株一组，利用荧光定量PCR特异性扩增待测组和野生型植株sgRNA区域的序列，获得的双链DNA进行HRM分析。

混有突变体的双链DNA经过高温解链、低温复性过程后会产生野生型与突变体的杂合双链DNA。在接下来的升温过程中，含有杂合双链的DNA会形成与仅含野生型双链DNA不同的熔解曲线，从而将群体之间的差异直观地显示出来，该方法的灵敏度可以达到1/20（见图D），即20个植株中有一个突变植株可被检出。他们选择了7株植株为一组进行HRM分析，即将42株随机平均分为6份，在鉴定出哪一组含有突变植株后，再将该组的7株植物分别提DNA，扩增含有sgRNA区域的片段，然后分别加入等量的野生型DNA扩增片段后进行HRM分析，鉴定出突变体。

最后一步则是利用特异PCR检测和其它方法从所有突变植株中鉴别出哪些为非转基因植株。用上述方法，该团队在随机选择的29株白化苗中，鉴定出5株（17.2%）的白化突变体不携带T-DNA，证实为非转基因突变体。

李义团队所报道的CRISPR瞬时表达体系和快速高效的筛选方法将在无性繁殖的多年生植物上有广泛的应用前景。其流程见图E（以1000株再生苗为例）。

A: 烟草外植体分两部分，一部分在共培养2，3，4，5，6 天后立即用GUS染液进行染色，此时信号包括瞬时表达信号和稳定表达信号；另一部分在共培养2，3，4，5，6 天后立即在含有杀菌剂的培养基上培养5天，然后用GUS染液进行染色，此时信号分别为共培养2，3，4，5，6 天时稳定表达的信号；结果发现，共培养的第3和第4天时达到瞬时表达的峰値。

B: 未添加筛选压的再生培养基上获得的白化突变体，同时再生出大量绿色野生型芽。

C: 高通量测序检测pds-12突变体中CRISPR/Cas9剪切产生的突变。横坐标为Cas9剪切位点附近序列及其核苷酸位置，红色TGG序列为Cas9剪切所需的PAM序列，纵坐标为位点突变频率。红色三角、黑色圆圈和蓝色方形分别代表含有41株野生型和一株pds-12突变体的母样品、100%野生型样品以及使用野生型样品对母样品进行7倍稀释得到的子样品中的突变频率。图中结果显示，在已确认的pds-12突变体突变位点AGATGAT（位置45-51），母样品的突变频率显著高于子样品和野生型样品；而在其他非突变位点，三类样品中的突变频率无明显差异。

D: 高分辨率熔解曲线（HRM）分析检测含有pds-12突变体的混样群体。其中红色曲线代表野生型群体（100% WT），蓝色曲线代表突变体和野生型1:1比例的混样群体（1mt:1wt），粉色曲线、绿色曲线和褐色曲线分别代表突变体和野生型1:6（1mt:6wt），1:19（1mt:19wt），1:29（1mt:29wt）的混样群体。结果显示蓝色曲线、粉色曲线和绿色曲线均能和红色曲线（野生型群体）明显的分开，该结果表明HRM分析的灵敏度能够达到1/20。

E: Cas9和sgRNA瞬时表达体系和快速高效的筛选方法流程图。

3该方法的优缺点

1）农杆菌介导的瞬时表达体系操作简单，植物种类的适用范围极为广泛，特别是近年来改良后的农杆菌能够侵染的植物已经从双子叶扩展到许多重要的单子叶植物。

2）由于在植株再生过程中不施加筛选压，此方法将大幅提高不定芽的再生效率。遗传转化再生过程中化学筛选剂的施加，会使很多植物的再生变得异常困难，从而难以获得转基因植物。该方法的整个再生过程中不存在筛选压，因此在许多植物中可能会大幅提高获得基因编辑突变体的可能性。但是，无化学筛选压导致的大量非突变植株的产生，也使突变体筛选工作量增大。

3）利用精心设计的高通量测序与HRM技术结合的两步筛选法，能够在两星期左右快速准确地从几千株再生芽中鉴定出突变株系。虽然，两步筛选体系可以极大地提高从大量再生植株中筛选突变体的效率，但整个实验流程还相对复杂。更为简单和高效的筛选方法尚有待研发。

4作者

该方法第一作者陈龙正为江苏农科院蔬菜所研究员，共同第一作者李威和丁静分别为中国农业大学园艺学院引进人才、副教授和南京农业大学园艺学院副教授。通讯作者李义为美国康涅狄格大学教授，南京农大园艺学院兼职教授（2个月/年）。