随着基因组编辑系统的发展，没有什么比CRISPR/Cas更简单的了。然而，在实践中，将该系统限定于预期的位点可能是具有挑战性的，尤其是两个或两个以上的位点只有一个单碱基差异的情况。哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的Benjamin Pruitt指出：“Cas9是杂乱的。在许多情况下，它将高效地切割两个等位基因。”这是生物医学中的一个问题，因为研究人员设想修复受损的基因拷贝，而单独留下野生型基因。

现在，Pruitt与哈佛大学医学院著名遗传学家George Church实验室的临床研究员Alejandro Chavez合作，为这个问题设计了一个潜在的解决方案，发表在生命科学预印本网站BioRxiv上，George Church是本文的共同通讯作者。

Cas9可以承受引导性RNA和靶序列之间的单个不匹配，但它可能无法承受更多。因此，该研究小组设计了一个引导性RNA筛查，使用引导性RNA——每个包含两个相对于野生型序列的突变，可切割赋予耐药性的一个特定突变，但它并非也切割野生型等位基因。一旦靶标突变成了不希望得到的序列，向导将仅通过一个单一不匹配而被关闭，从而使得Cas9切割和抑制不希望得到的副本。

该研究团队首先将该策略应用到β-内酰胺酶基因的一个特定突变，在高度致突变的背景中，这个基因编码氨苄青霉素的耐药性。含有一段对照引导性RNA的细胞，在氨苄青霉素上快速生长，而含有一个双突变体“调整向导RNA”（tgRNA）的细胞则没有。在这些细胞中，不需要的突变的出现，可诱导快速裂解，从而将该基因去除。

研究人员接下来将相同的方法应用链霉素和利福平耐药性的研究，表明该策略不仅适用于靶定大肠杆菌染色体本身，也可能是多路复用的。他们还表明，该策略可以在小鼠胃肠道的复杂环境中发挥作用。

据Chavez说，这种方法——应该转化到更高级的生物中，在基因治疗、合成生物学和进化生物学以及其他领域，都有潜在的应用价值。例如，它可用来确保转基因细菌不会获得特异性的不理想性状，或用来研究有机体在常见逃生通路被切断时的应激反应。只需要一组候选引导性RNAs——在这种情况下是27个。Chavez说：“那不是很贵。这很辛苦，但不是很贵。”

George M. Church是哈佛医学院著名的遗传学教授、Wyss研究所的核心成员，被誉为是个人基因组学和合成生物学的先锋。1984年，Church和 Walter Gilbert发表了首个直接基因组测序方法，一些策略现在仍应用在二代测序技术中。此外，他还发明了多重化分子技术和条码式标签，并作为纳米孔测序技术的发明者之一。

2014年9月，George M. Church教授领导哈佛医学院的团队，开发了单分子互作测序（SMI-Seq）技术，该技术能够实现单分子水平上的并行分析，获得大量蛋白质的互作图谱。相关阅读：遗传学大牛Nature发表新技术：单分子互作测序。随后的11月，他领导哈佛医学院的团队，在人iPS细胞中进行了CRISPR基因编辑。他们将全基因组测序和靶向深度测序结合起来，鉴定了Cas9编辑iPS细胞时的脱靶效应，还鉴定了一个影响Cas9特异性的单核苷酸变异（SNV）。这项研究发表在Nature Communications杂志上。相关阅读：遗传学大牛最新文章：CRISPR编辑iPS细胞的脱靶情况。

就基因表达而言，人们主要还是一次研究一个基因。去年3月，哈佛大学Wyss研究所的研究人员在George Church的领导下利用CRISPR/Cas9系统开发了一种革命性技术。该技术可以揭示一连串基因回路对生物过程的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。相关阅读：著名遗传学家获重要突破：Cas9随心所欲地激活基因。随后的7月份，该研究小组开发出了一种预测软件，可以准确找出最有效的方法利用CRISPR-Cas9基因编辑技术来实现基因打靶。这项重要的研究成果发布在《自然方法》（Nature methods）杂志上。