新一代测序技术开辟古基因研究新竞技场

来源：中国科学报   发布者：张荐辕   日期：2015-08-27  

当Kelly Harkins的博士研究——古结核病在2012年陷入僵局之后，她开始向更广泛的学界寻求帮助。她离开了美国亚利桑那州立大学（ASU）实验室，到德国图宾根大学进行4个月的访问。在该校古遗传学家Johannes Krause的实验室中，她听从了导师的建议：“做一个像一块海绵的研究者。”她学会了如何用复杂的下一代DNA测序技术检测古老的人体组织样本。 “后来我回到美国，把这项技术教给了ASU的所有研究生。”她说。这项精准的、有着上百年历史的微生物测序技术让她取得了一项惊人的发现：新世界（即南、北美洲及其附近岛屿）的古结核病有可能来自于海洋哺乳动物。 Harkins的经历和古遗传学研究领域的开拓者Svante Paabo可谓异曲同工。上世纪80年代初，作为瑞典本土的一名研究生，Paabo希望可以分析古木乃伊DNA，以找到现代埃及人和古代法老是否存在密切关联。但他担心导师可能会认为这项研究将徒劳无功。所以他只在晚上和周末作这项研究。“这是我‘真正’博士工作之外的副业，我一直在秘密地进行。”Paabo说，“而且只有我一个人。” 测序革命 但是Paabo和该领域其他一些先行者在研究过程中认识到，通过把DNA测序应用到经过时光破坏的古人体组织上，他们正在进行一场DNA测序革命。他们取得了出乎所有人预料的结果，最终追溯了尼安德特人和其他古人类的整个基因组序列，并绘制了人类进化路线图。研究人员还追溯了古动物的基因组序列，如迄今为止最古老的、距今70万年的马。但提取和分析退化DNA分子十分棘手，多年来该技术仅局限于为数不多的若干引人注目的实验室中。 现在，情况已然改变。随着测序和样本分析技术的提高，古人类学领域之外的研究人员已经意识到，古DNA可以告诉他们大量线索，目前该方法已被应用于从欧洲人口变迁到植物和病原体如何响应气候变化等各类研究中。“我们现在已经看到了相关研究的集中暴发。”Paabo说，“古DNA即将变成一种标准工具……成为许多研究项目不可分割的一部分……就像碳年代测定一样。” “这是一场革命。”Krause对此持同样看法，最近他刚从图宾根搬到耶拿，联合主持马普学会新人类历史科学研究中心。“现在，人人都可以利用这项技术，你可以和小实验室合作，发表高影响力的出版物。你也不需要多么精尖的设备，只需要知道怎么做。而现在已经有越来越多的人知道怎么做。” 上世纪80年代，在首个古DNA测序成功之后，这一领域一直受到样本污染的困扰，因为古DNA会被来自现代细菌或是技术人员手指的基因物质污染。最初，研究人员依靠聚合酶链反应（PCR）对古样本中生存的微小DNA片段进行扩大或测序，但是PCR会优先扩大较长的分子，而这些分子更有可能是来自现代的污染。比如，大量来自恐龙、美洲土著以及琥珀中昆虫的DNA结果均被污染，Paabo甚至也曾表示，几乎因此而放弃古人类样本研究。 然而，随着下一代测序技术不断发展，如今研究人员可同时对上千万个DNA片段测序，有时一天内就会检测出整个基因组序列。这种高通量测序方法不仅加快了测序速度，而且降低了成本，尽管配备一台古DNA测序设备依然昂贵。下一代测序技术不需要依赖PCR重构分子。新的测序方法可以对序列进行分析，这样一来“传说中的”古DNA手印——可能是以某种核苷酸为基础的优先退化——就可以得到辨识。缺乏该模式的序列可能就是现代污染，就可以被识别出来并丢弃掉。“其实，仍然要考虑到污染问题。”Harkins说，“但这种顾虑已经减少了许多。” 所有这些进步加上新的样品前处理方法，就可以让化石中的任何DNA的利用最大化。“15年前，我从未想过居然可以像现代人那样，对已经灭绝的早期智人测序。”Paabo说，他的实验室利用下一代测序技术在2010年对尼安德特人的完整核基因组序列进行了检测，并在2012年被广泛报道。 黄金时代 随着越来越多的实验室可以探索古DNA，它们逐渐把这一技术推广应用至许多新问题上。这些后来者“可以做一些我以前从未梦想会做的事情”，比如检测百万人基因组项目。加拿大麦克马斯特大学进化遗传学家Hendrik Poinar说：“我们正处于古DNA分析的黄金时代。” 据汤森路透科学网站数据统计，论文题目、摘要或关键词中含有“古DNA”一词的文章越来越多，相关论文已从1995年发表的30篇上升至2014年的275篇。其中约有14篇研究成果深入报告了关于早期智人的研究成果，其引用率尤其高，汤森路透分析专家把它们称作“研究前沿”。这些文章在2013年大量涌现，表明了一个以相对新颖的文献为基础的新领域的兴起。 尽管古DNA分析已经变得越来越强大和标准化，研究人员仍在找寻新的地方进行古基因序列检测。质密耳骨中保存的DNA惊人地完好，牙齿上的噬斑也是如此，这些为了解古代人饮食及肠道菌群打开了新的竞技场。其他研究人员则在对古代土壤或冰体中发现的DNA进行测序，以重新构建历史上的生态系统。还有研究人员在探索如何把在热带雨林中发现样本的古DNA提取出来，因为那里炎热和湿润的气候会破坏有机体分子。还有一些研究人员在观察该领域研究的地平线，分析古蛋白质测序的下一项突破性技术可能是什么。 然而，目前来看，古遗传学仍占据主导地位，甚至吸引了其他跨度较大的学科领域研究人员的注意力。“我对古DNA本身没什么兴趣，我主要是对那些仍然影响现代人生活的疾病感兴趣。”微生物学家、现在路易斯安那州巴吞鲁日国家麻风病项目中心做访问学者的Pushpendra Singh说。但是他和瑞士联邦理工学院时任博士后导师Stewart Cole希望了解，和1000年前相比，为什么今天欧洲人得麻风病的人数少得多。是不是因为随着时间的演变，麻风分枝杆菌的毒性变弱了？ 为了了解其中的原因，Singh也到图宾根大学访问，在Krause的实验室学习古DNA研究技术。最终，该团队对5种中世纪样本进行了测序，其中包括一种DNA保存特别完整的微生物。在和Cole、Krause以及其他同事的合作过程中，他发现中世纪时的麻风菌基因序列和现在大体相同，而其他一些因素——比如或与其他疾病发生合并感染或是保护突变的进化——可能有助于解释麻风病在欧洲感染率的下降。 其他的实验室也在探索从古米诺斯人和古迈锡尼人之间的关系到马铃薯疫病的家庭谱系等各种问题。“现在，我每周都会接到研究人员的电话，希望给他们提出建议。”Krause说。 竞技实力 与此同时，为数不多的若干个精英实验室因为有大批资金的支持，依然在该领域遥遥领先。正如Krause所形容的那样，这些“巨头”在研究新技术，解决更加复杂的问题。“我们的策略是探索那些有难度的问题，走在科技的前沿。”Paabo说，他给自己的团队提出的挑战是，在未来5年至少对100名距今3万年以上的古人类基因进行测序。“我们把它叫作‘100名古人类基因’项目。”他说。 年代如此久远的古样本序列经常要反复检测二三十次，甚至是四十多次，每次测序的花费需要2000美元甚至更高，以增加测序结果的可靠性。“现在，要把这些事情做好，成本仍然很昂贵。”加州大学伯克利分校人类遗传学家Rasmus Nielsen说。 同样，古基因污染问题也依然存在。但无论如何，对于Harkins这代科学家来说，已经面临着伴随该领域迅速崛起的热潮而来的各种问题，包括激烈竞争。“比如，现在全球至少有5个实验室在进行猛犸象基因测序，铜器时代的古人类基因测序也是如此。”Krause说。 但Harkins表示，该领域同样有许多挑战性的科学问题亟待解决。“我们可以研究人口层面的问题，可以研究免疫学相关的问题。总之，除了这种选择，总会有另外一种选择。”她说。“这的确是个很棒的领域。”

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